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Testsysteme
AlamarBlue Assay , Ames Test , Bakterienkontakttest , Comet Assay , Cytochrom P450 , Cytotoxizitätstest , Elektronenmikroskopie ,
EROD Assay , Fischeitest , Fish Sexual Development Test , Histopathologie , Life Cycle Test , Limnologie , Respirometrie , Zellkultur
In vitro-Testverfahren
Bakterienkontakttest ist besonders gut zur Untersuchung von Sedimenten, Schwebstoffen und Bodenproben geeignet, da der Testorganismus Arthrobacter globiformis als einer der häufigsten Bodenorganismen auch in der Natur direkt mit dem zu untersuchenden Medium in Kontakt steht. Aufgrund ihrer Funktion als Destruenten und ihrer hohen Abundanz in Böden und Sedimenten sind Mikroorganismen bedeutende Bioindikatoren für diese Kompartimente. Sie stellen ein System dar, das gleichzeitig einen Organismus und eine Zelle repräsentiert, und bei dem aufgrund der kurzen Generationszeit sowohl akut toxische als auch chronische Effekte untersucht werden können. Ein weiterer Vorteil dieses Tests beruht darauf, dass er für einen Biotest verhältnismäßig schnell, d.h. innerhalb von 1 - 1 ½ Tagen durchzuführen ist, da Mikroorganismen Schadstoffe viel schneller aufnehmen als höher entwickelte Organismen. Der Bakterienkontakttest wird daher als einfacher Screening- test für eine Testbatterie zur Sedimentbewertung empfohlen und ist auch als DIN 38412 L48 festgeschrieben.
Die Biotransformation von lipophilen Xenobiotika in wasserlösliche, ausscheidbare Produkte erfolgt sehr häufig über die Cytochrom P450-Enzymfamilie und umfasst vor allem Oxidation, Reduktion und Hydrolyse. Die CYP1A-Unterfamilie metabolisiert hauptsächlich PAHs, PCBs sowie Dioxine und Furane. Diese Schadstoffe aktivieren das CYP1A-Enzymsystem über den cytosolischen Arylhydrogenrezeptor, wobei die Bindungsstärke des Liganden proportional zru Genexpression und damit zur Toxizität ist.
EROD Assay: Dieses Testverfahren ist eines der am häufigsten angewandten Methoden zur Analyse der Induktion von CYP1A. Die Induktion von CYP1A wird in diesem Biotest über die Aktivität des Biotansformationsenzyms 7-Ethoxyresorufin-O-Deethylase (EROD) gemessen. In Gegenwart von NADPH (β-Nikotinamid-Adenindinukleotid-Phosphat) ist dieses Enzym in der Lage, das künstliche Substrat 7-Ethoxyresorufin zu Resorufin zu deethylieren. Eine Bewertung der Toxizität der Probe erfolgt durch einen Vergleich mit den EROD-Werten von TCDD.
Die akute Schädigung von Zellen wird häufig mit dem Endpunkt Neutralrot untersucht. Dieser Endpunkt wurde in In vitro-Cytotoxizitätstests erstmals von Borenfreund und Puerner (1984) an einer Mäusezelllinie beschrieben. Der Vitalitätstest beruht auf der Annahme, dass nur intakte Zellen den leicht basischen Farbstoff Neutralrot in ihren Lysosomen zurückhalten können. Werden durch cytotoxische Substanzen die Zellmembran oder die lysosomale Membran geschädigt, schlägt sich dies in einer verminderten Farbstoffretention nieder. Diese kann durch photometrische Messung ermittelt werden.
Fischei-Test: In den vergangen Jahren gewann der Fischei-Test mit dem Zebrabärbling (Danio rerio) als Alternativmethode zum Fisch-Test immer größere Bedeutung. Der Fischei-Test zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass er mit geringen Aufwand und realtiv geringen Probenmengen durchgeführt werden kann. Außerdem bietet der Zebrabärbling den Vorteil, das er relativ einfach im Labor zu halten ist, die Weibchen bis zu 200 Eier pro Tag ablaichen, die Eier transparent sind und eine konstante Entwicklung aufweisen, sowie ein hoher Kenntnisstand hinsichtlich der Entwicklungsbiologie vorhanden ist. Beim Fischei-Test können unterschiedliche akut toxische und subletale Endpunkte untersucht werden, wodurch eine differenzierte Aussage über das Schädigungspotential der unterschiedlichen Proben getroffen werden kann.
Gentoxizität
Man kennt unterschiedliche Substanzklassen mit gentoxischen und mutagenen Eigenschaften, dazu zählen PAHs, Nitrosamine, Salze von Schwermetallen und halogenierte Verbindungen (z.B. PCBs). Um die Schadwirkung solcher Susbstanzen nachzuweisen, werden unter anderem der Ames-Test, der Comet-Assay und der Mikrokerntest eingesetzt.
Ames-Test: Einer der am häufigsten verwendete Bakterientests zur Bestimmung des mutagenen Potentials von Wasser- oder auch Sedimentproben ist der Ames-Test mit Salmonella typhimurium. In diesem Verfahren werden zwei histidinbedürftige (his-) Stämme (TA98 und TA100) einer Testsubstanz ausgesetzt. Die Anzahl der durch Frameshift- (TA98) oder durch Basenaustauschmutationen (TA100) entstanden histidinunabhängigen (his+) Kolonien (Revertanten) dient als Maß für die mutagene Aktivität.
Comet Assay: Mit diesem Verfahren lassen sich in nahezu allen eukaryontischen Zelltypen DNA-Strangbrüche auf dem Niveau der Einzelzelle detektiern, die durch Monosubstanzen, Susbtanzgemische oder Umweltproben verursacht werden. Nachweisbare Effekte sind Einzel- und Doppelstrangbrüche, apurinische / apyrimidinische Stellen und Cross-Links. Aßerdem stellte die Intensität der zellulären Reparatur ein indirektes Maß für die Bildung von Addukten dar.
Mikrokerntest: Dieser Test wurde vor über 25 Jahren entwickelt, um cytogenetische Schäden an Zellen zu messen. Mikrokerne entstehen bei der Zellteilung, wenn Chromatinfragmente ohne Centromer nicht in die Kerne der Tochterzellen wandern sondern im Cytoplasma verbleiben, oder wenn Fehlfunktionen des Spindelapparates dazu führen, dass Chromosomen während der Anaphase nicht in den Kern eingeschlossen werden. Induziert wird die Bildung von Mikrokernen unter anderem durch Strahlung oder Chemikalien, die Chromosomenbrüche oder Fehlfunktionen im Spindelapparat verursachen.
RTL-W1-Zellen: 1985 wurden von Bols et al. die Fibroblasten-ähnliche Zelllinie RTL-W1 aus Primärhepatocyten der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) isoliert und 1993 von Lee et al. charakterisiert. Diese Zelllinie zeichnet sich insbesondere durch eine hohe Biotransformationsleistung aus. So konnte nach Belastung mit PAHs und TCDD die Induktion des Enzyms P4501A nachgewiesen werden.
RTG-2-Zellen: Die Fibroblasten-ähnlichen RTG-2-Zellen wurden bereits 1962 durch Wolf und Quimby aus den Gonaden der Regenbogenforelle Oncorhynchus mykiss isoliert (RTG = rainbow trout gonade) und seit dieser Zeit kultiviert. Zum Ausgleich der geringen Biotransformationskapazität der RTG-2-Zellen kann im Testsystem eine metabolische Aktivierung durch S9-Mix durchgeführt werden, um auch Schadstoffe zu erfassen, die erst nach Aktivierung durch Biotransformationsenzyme der P450-Familie eine toxische Wirkung entfalten.
V79-Zellen: (Beschreibung folgt in Kürze)
In vivo-Untersuchungen
Schädigungen des Gesamtorganismus durch Umweltchemikalien lassen sich nicht nur auf Ebene der Gewebe nachweisen, sondern natürlich auch auf zellulärer Ebene. Das Elektronenmikroskop ermöglicht den Nachweis von Effekten von Umwelt- chemikalien auf zellulärer Ebene und darüber hinaus auf Organellebene. Hierbei ist jedes betroffene Organ untersuchbar, wobei der Schwerpunkt natürlich auf Organen liegt, die eine zentrale Rolle im Stoffwechsel einnehmen, beispielsweise die Leber.
Sauerstoff ist essentiell für jedes höhere Lebewesen, um eine entsprechende Menge an ATP für die Energieversorgung mittels mitochondrialer, oxidativer Phosphorylierung zu generieren. Daher ist der Sauerstoffverbrauch (OCR). ein wichtiger Parameter, um den Einfluss von wechselnden Umweltbedingungen oder chemischen Behandlungen auf den gesamten Metabolismus eines Organismus, sowie auf die Funktion der Mitochondrien zu untersuchen. Optische Fluoreszenz-Sauerstoffmessung in Mehrkanalsystemen ist eine gängige Methode, um den individuellen Sauerstoffverbrauch in sehr kleinen Organismen in Echtzeit zu bestimmen.
Auf Grund verschiedener Einflüsse (z. B. Umweltchemikalien) kann es in Geweben von Tieren zu histopathologischen Veränderungen kommen. Je nachdem welche Organe betroffen sind, kann dies negative Effekte auf den Organismus und evtl. auch die Population haben. Mit Hilfe von lichtmikroskopischen Untersuchungen lassen sich Gewebe analysieren und die Veränderungen bewerten. Zu diesem Zweck werden Paraffinschnitte angefertigt und gefärbt. Die visuelle Auswertung am Lichtmikroskop kann durch Software unterstützt werden um bestimmte Strukturen morphometrisch erfassen zu können und quantitativ auswertbar zu machen.
Neben der Respirometrie bietet der AlamarBlue® Assay eine schnellere Alternative, um die Atmungsaktivität im Zebrabärbling in vivo über die Stoffwechselrate zu messen, welche eine indirekte Messung des Sauerstoffverbrauchs darstellt. Dieser Hochdurchsatz-Test mit Zebrabärblingsembryonen wurde ursprünglich von Renquist et. al. (2019) entwickelt. Der Assay basiert auf der Konformationsänderung des dunkelblauen, nicht-fluoreszierenden Resazurins in das pinke, fluoreszierende Resorufin mittels metabolischer Reduzierung in Anwesenheit von Sauerstoff. Resazurin diffundiert leicht durch Zellmembranen, wo es dann in der Zelle Elektronen von metabolisch-aktiven Enzymen ((i.e. NADH2) während der Zellatmung akzeptiert. Daher kann die Veränderung in der Resorufin-Fluoreszenzintensität mit dem metabolischen Output des Organismus in Bezug gesetzt werden und so beispielsweise unter verschiedenen Umweltbedingungen oder chemischen Behandlungen getestet werden.
Der „fish sexual development test„ (FSDT) wurde im Rahmen der Evaluation für die Phase 2 der angepassten OECD-Guideline 210 „Fish, Early-life Stage Toxicity Test erprobt. Die sexuelle Entwicklung von Fischen soll beobachtet und dokumentiert werden, um daraus Rückschlüsse auf die endokrine Wirksamkeit der zu untersuchenden Substanzen zu ziehen. Das angewandte Testverfahren soll in kurzer Zeit, mit wenig logistischem und finanziellem Aufwand eine möglichst verlässliche Aussage über eine potentielle endokrine Gefährdung geben. Verschiedene Fischarten wurden erprobt, bisher hat sich der Zebrabärbling (Danio rerio) bewährt. Auf Grund der Tatsache, dass seine sexuelle Differenzierung und Entwicklung der Gonaden nach 60 Tagen abgeschlossen ist, liefert diese Form von Untersuchung ausreichende Daten bezüglich der endokrinen Wirkung einer Substanz. Parameter wie Geschlechterverschiebung, Entwicklungsverzögerung und allgemeine Pathologie können schnell und kostengünstig erfasst werden. Mögliche Veränderungen im Reproduktionserfolg der Fische können in diesem Test nicht erfasst werden, er kann allerdings als Basis für längerfristige Untersuchungen (Full life-cycle) dieser Art dienen.
Morphologische und chemisch-physikalische Parameter
Zur Beurteilung der Gewässergüte werden in Deutschland regelmäßig eine Anzahl verschiedener morphologischer, chemischer und physikalischer Parameter aufgenommen und in den Gewässergüteberichten der Länder zusammengefasst (LAWA 1998). Dazu gehört die Beschreibung des Flussverlaufs und der Ufergestaltung, Fließgeschwindigkeit, Geruch, Färbung, pH-Wert, elektrische Leitfähigkeit, Nitrat-, Ammonium-, Nitrit- und Phosphatkonzentration, Sauerstoffgehalt sowie BSB5. Auf der Grundlage dieser Messdaten und des Saprobien-Index kann dann die Güteklassifikation nach der Länderarbeitsgemeinschaft Wasser (LAWA) erstellt werden, wodurch eine vergleichbare Bewertung des Belastungszustands verschiedener Gewässer möglich ist.
Makrozoobenthos
In der ökologischen Bewertung von Fließgewässern ist neben der Aufnahme morphologischer und chemisch-physikalischer Parameter die Erfassung des Artenspektrums, vor allem des standorttreuen Makrozoobenthos, von besonderer Bedeutung. Die Bestandsaufnahme der benthischen Fließgewässergemeinschaft bietet den Vorteil, dass die Gegenwart oder das Fehlen bestimmter Arten eine integrative Aussage über den Gewässerzustand erlaubt, die relativ weit in die Vergangenheit reichen kann.
